ATP Assay Kit-Luminescence

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

ATP Assay Kit-Luminescence

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• ミトコンドリア関連
• 細胞内代謝

ATP測定キット

• 安定した発光による高感度検出
• 標準品の同梱で、不安定なATPの秤量が不要
• 試薬を加えるだけの簡単な操作

• 製品コード
  A550　 ATP Assay Kit-Luminescence

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マニュアル

ATPの測定原理

ATP Assay Kit-Luminescenceは、培養細胞中のアデノシン三リン酸(ATP)量をホタル・ルシフェラーゼ発光法で定量するキットです。
本キットではマイクロプレートを用いた多検体測定が可能です。

Q

1キットで測定可能なサンプル数を教えて下さい

A

検量線の作成およびサンプルの測定をそれぞれn=3で行った場合、以下のサンプル数を測定できます。
96ウェルプレートのレイアウト例については、取扱説明書をご参照ください。
　・50 tests ：8サンプル
　・200 tests：48サンプル(96 ウェルプレート2枚で検量線を2回測定した場合)

Q

発光シグナルはどの程度安定ですか？

A

発光シグナルは3時間安定です。ただし、温度と光が発光に影響しますので、すぐに測定できない場合は、遮光し温度を一定(25℃付近)に保てる場所で静置してください。

Q

測定用のプレートは白色以外のプレートを使用できますか？

A

測定はできますが、ブラックプレートや透明プレートを用いた場合、発光強度が下がります。
また、透明プレートの場合はブランクが高くなりますので、白色プレートを推奨しております。

Q

測定試料は保存できますか？

A

ATPが不安定なため保存できません。実験後は直ぐにWorking solutionを添加し、3時間以内に測定してください。

Q

Working solutionは保存できますか？

A

冷凍(-20℃)で30日間の保存が可能です。
凍結融解を繰り返すことは試薬の劣化を招く恐れがありますので、その場合はあらかじめ小分けしてから保存することをお勧めします。

Q

組織を用いた実験例はありますか？

A

マウス肝臓組織を用いてATPおよびNAD/NADH量を測定した事例がございます。
実験操作の詳細は下記をご参照ください。

アルカリ抽出法による肝臓サンプルからの代謝指標の抽出

1. マウス肝臓100 mgあたり500 µlの冷えた0.5 mol/l KOH水溶液を入れる。
　*使用する組織は必ず灌流操作等で十分に脱血してください。血液の残存は測定に影響を与えます。

2. ダウンス型ホモジナイザーで組織を破砕する。
　*氷浴上で行ってください。

3. サンプルを回収し、サンプルチューブに移す。破砕に使用した容器を500 µlの冷えた0.5 mol/l KOH水溶液で共洗いし、チューブ内のサンプルと合わせる。
　（全量 1 ml）

4. 冷えた超純水 1 mlをサンプルチューブに加え、よく混合し氷上で5分間静置する。（全量 2 ml）
　*溶液の粘性が高いと、次操作の遠心後の分離が困難になる場合があります。その際は、シリンジに25 G(針のゲージ数)程度の細い針を付け、サンプル溶液をシリンジでスムーズに出し入れができるまで(20-30回)混合してください。

5. 12,000 x g , 4℃で5分間遠心し、上清を900 µlずつ二つのサンプルチューブに回収する。
　*１本をATP測定、もう１本をNAD/NADH測定に使用。ATPのみを測定する場合は900 μlx1本のみで構いません。

 

ATP測定用サンプルの調製
6. 上記5. で調製した900 µlのサンプルに200 µl の1 mol/l KH₂PO₄水溶液を入れ中和し、よく混合後氷上で5分間静置する。

7. 12,000 x g , 4℃で5分間遠心し、上清1 mlをサンプルチューブに回収し測定用サンプルとする。

 

<測定時の注意点>
*操作5、7で得たサンプルは保存できません。その日のうちに測定してください。
*スタンダード、サンプルの希釈には希釈用溶液として0.5 mol/l KOH水溶液と1 mol/l KH₂PO₄水溶液を9:5の比率で混合したものを使用してください。

＜測定例＞
NASH誘導マウス肝臓組織におけるATP量の変化

 

Q

発光測定の波長を教えてください。

A

本キットには、ホタルルシフェリンを使用しているため、発光測定の波長は556nmとなります。

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