凯杰试剂盒REPLI-g Single Cell Kit (24) 分子生物试剂
- 产品型号： 150343
- 简单描述
- 凯杰试剂盒REPLI-g Single Cell Kit (24)应用 仪器全基因组测序二代测序平台†外显子组测序SNP基因分型芯片芯片平台†Array CGHqPCR/PCR技术Real-time PCR/PCR仪†Sanger测序毛细管测序仪†焦磷酸测序PyroMark (QIAGEN)
凯杰试剂盒REPLI-g Single Cell Kit (24)
Performance
覆盖基因组所有位点，十分适用于二代测序和其他下游应用
REPLI-g Single Cell Kit扩增的DNA平均长度大于10 kb，并且覆盖所有基因组位点。该产品已经过验证，适用于二代测序、基于芯片技术的比较基因组杂交（aCGH）和real-time PCR应用等多种下游分析。使用该产品无需单独进行PCR扩增，减少了手动操作，获得的产物长度PCR方法更长（参见”Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods”）。用扩增产物进行二代测序，获得高品质结果。这表明该试剂盒的位点覆盖率大，错配率低，其扩增的DNA（甚至从单一细菌细胞中扩增的DNA）能够与纯化获得的基因组DNA相媲美（参见”Comparable NGS results”）。另有研究对人类常染色体和X染色体上的多个标记物进行了分析，三个独立的实验均显示：基因组的所有位点被成功扩增，没有遗漏任何一个位点（参见”Complete genome coverage”）。
REPLI-g Single Cell Kit的表现优于其他供应商的试剂盒
其他供应商的试剂盒基于PCR技术进行全基因组扩增，获得的产物片段较短，带有PCR引物序列，可能影响下游应用。基于PCR的全基因组扩增容易出现错误，会导致碱基对突变、STR的减少或增多，使用低保真Taq DNA聚合酶会导致位点缺失。相反，REPLI-g Single Cell Kit能够进行高度均一的全基因组扩增，位点偏差小。对四个试剂盒进行了检测，其中两个利用多重置换扩增技术（包括REPLI-g Single Cell Kit），另外两个利用PCR技术。采用单一细胞扩增实验方案对所有试剂盒进行序列位点检测。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供应商的试剂盒都出现了位点的遗漏（参见”Unbiased DNA amplification from a single cell”）。
凯杰试剂盒REPLI-g Single Cell Kit (24)
Principle
REPLI-g Single Cell Kit含有REPLI-g sc Polymerase，这是一种优化的新型高保真Phi 29聚合酶。该试剂盒采用多重置换扩增技术扩增复杂的基因组DNA，温和的碱孵育能够避免DNA片段化，促进对所有位点的无偏差扩增。该试剂盒十分适用于分离的肿瘤细胞或细菌细胞等单一细胞，能够扩增获得高产量DNA（参见表1）。此外，该试剂盒还配有专用于鲜血或干血、新鲜或冷冻组织的实验方案，可用于多种研究样本。常规DNA产量可达40 µg，对模板的起始量要求低，因此进行后续遗传分析时无需检测DNA浓度。REPLI-g Single Cell Kit的扩增产物平均长度超过10 kb，且覆盖所有位点，适合于多种应用，包括二代测序、基于芯片技术的比较基因组杂交、焦磷酸测序和real-time PCR分析（参见表2）。
| 应用 | 仪器 |
|---|---|
| 全基因组测序 | 二代测序平台† |
| 外显子组测序 | |
| SNP基因分型芯片 | 芯片平台† |
| Array CGH | |
| qPCR/PCR技术 | Real-time PCR/PCR仪† |
| Sanger测序 | 毛细管测序仪† |
| 焦磷酸测序 | PyroMark (QIAGEN) |
扩增原理
REPLI-g Single Cell Kit采用等温基因组扩增技术，即多重置换扩增（MDA）。六聚体与变性DNA随机结合，然后在等温条件下，在优化的Phi 29聚合酶作用下，发生链置换合成反应。每个置换后的单链作为模板，与引物结合，可扩增获得高产量DNA（参见”Multiple Displacement Amplification (MDA) technology”）。Phi 29聚合酶为噬菌体衍生酶，具有3'→5'引物外切酶活性（校正活性），其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在优化的REPLI-g Single Cell缓冲液体系中，能够轻松的打开发卡结构等二级结构，因此可促进扩增时聚合酶正常工作。可扩增获得长达100 kb的DNA片段（参见”Unbiased amplification with Phi 29 polymerase”）。
细胞裂解和DNA的碱变性
基因组DNA在用于酶促扩增反应前必须经过变性，而这一变性过程通常使用高温或高pH值（强碱）孵育。REPLI-g Single Cell Kit采用温和的碱孵育，在细胞裂解、DNA变性的同时，确保DNA片段化程度小，不产生碱基突变。因此扩增获得的DNA完整度高，产物长度长，覆盖位点多（参见”Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation”）。
高效去除可检测到的DNA污染
REPLI-g Single Cell Kit中的所有组分都经过了dute的去污染流程，避免扩增产物被污染。在标准化流程中，对缓冲液和试剂进行紫外线照射，确保其不会污染DNA（参见”Innovative decontamination procedure”）。紫外线照射后，对试剂盒的所有组分进行严格的质量控制，确保其性能。
Procedure
简单的单管操作
REPLI-g Single Cell Kit可对单一细胞或有限的样本进行简便、可靠、准确的全基因组扩增。反应体系构建十分便利、可靠，仅需15分钟左右的手动操作（参见”REPLI-g Single Cell Kit procedure”）。专用的缓冲液和试剂可对单一细胞、有限的组织材料、或纯化的DNA进行扩增，产量高、位点覆盖率大（参见表3）。REPLI-g技术扩增获得的DNA可在–20°C长期储存（参见”Consistent long-term stability”）。请参见表4，了解REPLI-g产品线的更多信息。
| 试剂盒成分 | 优势 |
|---|---|
| REPLI-g sc Polymerase | 最长可达70 kb的长片段 |
| 保真性是Taq聚合酶的1000倍 | |
| 覆盖所有位点 | |
| 均一扩增所有位点 | |
| REPLI-g sc Reaction Buffer‡ | 对所有位点进行无偏差的扩增 |
| Buffer DLB （裂解和变性） | 高效扩增 |
| 不损伤DNA | |
| 紫外线照射去除污染 | 减少可检测到的残留DNA污染 |
| REPLI-g Single Cell | REPLI-g Mini | REPLI-g UltraFast Mini | REPLI-g Midi | REPLI-g Screening | REPLI-g FFPE | REPLI-g Mitochondrial DNA | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 起始材料 | 单一细胞、gDNA | 纯化的基因组DNA、血液、细胞 | 纯化的基因组DNA、血液、细胞 | FFPE组织、FFPE组织中纯化的基因组DNA | 纯化的基因组DNA | ||
| 另外提供其他起始材料的实验方案 | |||||||
| 起始量 | 单一细胞、2–1000各细胞、组织、纯化的gDNA （1–10 ng） | >10 ng gDNA、0.5 µl血液或细胞（>600个细胞/µl） | >10 ng gDNA、0.5 µl血液或细胞（>600个细胞/µl） | 组织切片（直径1 cm，厚度10–40 µm）；>100 ng gDNA | >1 ng纯化的gDNA | ||
| 产量（µg/反应） | 40 | 10 | 7–10 | 40 | 8 | 标准产量：≤10; 高产量：≤40 | 3–5 |
| 反应时间 | 8–16小时 | 10–16 小时 | 1.5小时 | 8–16小时 | 12–16小时 | 标准产量：4小时；高产量：10小时 | 8小时 |
| 手动操作时间 | 15分钟 | 15分钟 | 15分钟 | 15分钟 | 15分钟 | 40分钟 | 15分钟 |
| 规格 | 反应管 | 反应管 | 反应管 | 反应管 | 孔板 | ||
Applications
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二代测序
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采用TaqMan引物/探针对进行的SNP基因分型
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基于qPCR和PCR的突变检测
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STR/微卫星分析
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Sanger测序
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焦磷酸测序
-
aCGH等芯片技术
