CRISPR全基因组sgRNA文库系统酶试剂盒Takara


CRISPR全基因组sgRNA文库系统
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Clontech 632646 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System 5 Screens ¥21,144 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统
Clontech 632647 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit 10 Rxns ¥7,004 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统
Clontech 632651 Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit 20 Rxns ¥3,445 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统
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CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统
 
 
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CRISPR全基因组sgRNA文库系统
· 包含超过76,000条基于Brunello文库的sgRNAs,既可以实现更高的靶向特异性和靶向活性,
   同时也可以保持很低的脱靶效应点击下载sgRNA representation data.
· 每一个人类基因对应4条高活性sgRNAs, 可以通过单一模块进行筛选
· 优化后的sgRNA scaffold有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用,实现高基因编辑效率
· 慢病毒sgRNA文库已与Lenti-X Packaging Single Shots和Xfect Transfection Reagent
   配制在一起,因此只需要加入水就可以获得高效转染混合液,用于转染Lenti-X 293T cells
   制备高滴度慢病毒sgRNA文库
· 自失活慢病毒载体保证慢病毒制备和使用过程中高水平的生物安全性
 
Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System可以使用CRISPR/Cas9在人细胞中轻松实现全基因组表型敲除筛选。Lenti-X Single Shots包含了全基因组sgRNA文库和Cas9表达系统,可方便制备出稳定表达Cas9和sgRNA文库的细胞系进行每一次筛选。该sgRNA文库是基于Brunello文库 (Doench et al. 2016; Doench, 2018) 所构建的,包含了超过76,000条向导RNA以及非靶向sgRNA对照,每一个人类基因对应4条高效率sgRNAs,可对大约19,000个基因进行有效筛选。文库筛选后,使用Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit制备NGS样品进行新一代测序分析,此试剂盒包含了以sgRNA文库转导后的细胞来制备NGS样品所必需的引物和试剂。
 
我们精心构建这个sgRNA文库以确保其固有的sgRNA代表性。在文库合成、扩增、病毒制备和靶细胞转导每一步操作过程中,我们都会对sgRNA代表性进行检测。Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System包含经过验证的构建在慢病毒载体上的sgRNA文库和Lenti-X 293T cells,这个sgRNA文库以脱水形式提供。只需要添加水至冻干的文库混合物中就可以获得高效转染混合液,然后将混合物添加至293T细胞的培养液中进行转染就可以制备获得慢病毒粒子。每一批sgRNA文库都通过NGS进行了检测,确保超过90%的sgRNAs在10倍分布范围以内。我们也优化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中的sgRNA scaffold序列,有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用,实现高基因编辑效率。本系统通过使用高滴度的慢病毒包装系统Lenti-X Packaging Single Shots,可以有效维持慢病毒sgRNA文库的代表性。
 
应用:
· 人细胞全基因组表型筛选
· 功能缺失型遗传筛选
 
注意事项:
· Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit (Code No. 632651) 包含了扩增sgRNA进行
   NGS分析的所有引物和试剂,起始样品为从筛选出的细胞群分离提取的基因组DNA,
   此试剂盒可用于制备10个测序文库(20 PCRs)。
· Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit (Code No. 632647)包含
   Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit和基因组DNA纯化试剂以及PCR产物纯化试剂。
 
参考文献:
Doench, J.G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nat. Rev. Genet.19, 67 80 (2018).
Doench, J.G. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 34, 184 191 (2016).
 
Technical Notes
CRISPR全基因组sgRNA文库系统 Performing a phenotypic screen using the Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System
 
CRISPR screening webinar
Lentiviral CRISPR/Cas9 knockout screening made simple
 
 
实验例:
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图1 Guide-it CRISPR sgRNA文库所使用的载体和sgRNA scaffold示意图。Panel A. 从pLVXS-EF1a-Cas9-PGK-Puro和pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg 载体图谱中我们可以观察到所使用的慢病毒载体骨架。这些慢病毒载体经过了自失活处理,以提高病毒制备和使用过程中的生物安全性。pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体包含一个IRES连接的双顺反子表达框,可以同时表达mCherry红色荧光标记和潮霉素抗性筛选标记。sgRNAs由人U6启动子表达,包含经过优化的scaffold序列,可以高效招募Cas9,实现更高的基因编辑效率(Panel B)。
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图2 通过mCherry红色荧光判断慢病毒sgRNA文库的转导效率。按照用户手册的指导来制备慢病毒sgRNA文库,转染48小时后收集慢病毒粒子,以不同的MOIs转导表达Cas9的A375细胞。接种培养转导后的细胞,转导48小时后通过荧光显微镜和FACS 检测转导效率。
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图3 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System包含的sgRNA代表性分析。Panel A. 质粒文库中的sgRNA代表性分析。将基于Brunello的sgRNA文库克隆至pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体并进行扩增,通过NGS验证这个质粒文库中的sgRNAs代表性。检测结果显示,这个文库中超过90%的sgRNAs在10倍分布范围以内。图表中的柱形表示具有特定读段数的sgRNA数量。Panel B. 比较质粒文库和转导细胞中的sgRNA代表性。以潮霉素为筛选标记,筛选出Cas9+/sgRNA+ A375细胞,提取基因组DNA并进行PCR扩增。测序分析PCR产物,检测PCR产物中每一个整合的sgRNA相对于起始质粒DNA文库的读数。Spearman和Pearson相关性分析结果显示这两者都具有强相关性,这说明这个系统无论是在经过转导的细胞中还是筛选后的细胞中都可以有效保持sgRNA的代表性。
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图4 使用6-硫鸟嘌呤(6-TG,一种核苷酸类似物癌症治疗药物)作为筛选标记进行sgRNA文库筛选的操作流程示意图。sgRNA文库转导Cas9+ A375细胞后,进行潮霉素筛选、细胞扩培,之后将Cas9+/sgRNA+细胞传代至两个培养皿中。在其中一皿Cas9+/sgRNA+细胞培养液中添加6-TG,另外一皿细胞不添加6-TG使用常规培养条件进行培养。细胞扩培之后,使用Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit提取基因组DNA并制备测序样品。
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图5 从6-thioguanine (6-TG)筛选出的细胞中分离提取sgRNAs进行鉴定分析。Panel A. 比较用于制备慢病毒的原始质粒文库和转导后未经筛选/筛选后细胞中的sgRNA代表性。作用于HPRT(红点)和NUDF5的4条sgRNAs(黑点)均富集在6-TG筛选过的细胞中。在质粒文库(灰色)和转导后未经筛选的细胞(橘色)中,这些sgRNAs的表征也是可以检测到的。Panel B. 在经过6-TG筛选后的细胞中,sgRNA的代表性就发生了转变(蓝色)。在这个相关性分析中,重点标注出了被富集的单个sgRNAs(红点和橘点)。插图显示了与未经筛选的细胞相比,在筛选后的细胞中作用于HPRT的4条sgRNAs的富集倍数。
 
■ 产品组份
Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System(Code No. 632646)
Guide-it Cas9 Lentiviral Transfection Mix 5 vial
Guide-it Lentiviral sgRNA Library Transfection Mix 5 vial × 2
pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg Vector (0.5 μg/μl) 10 μl
Lenti-X 293T Cell Line 1 ml
Lenti-X GoStix Plus  
· Chase Buffer 3 ml
· Lenti-X GoStix Plus 3 testes
· p24 Control 5 testes
   
Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit(Code No. 632651)
LVXS P5 primer pool with index 1 (10 μM) 100 μl
LVXS P7 primer with index 2 (10 μM) 100 μl
LVXS P7 primer with index 3 (10 μM) 100 μl
LVXS P7 primer with index 4 (10 μM) 100 μl
LVXS P7 primer with index 5 (10 μM) 100 μl
TaKaRa Ex Taq (5 U/μl) 30 μl
10X Ex Taq Buffer (Mg2+ plus) 500 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each) 400 μl
   
Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit(Code No. 632647)
Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit(Code No. 632651)
NucleoBond CB 500(Code No. 740509)
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Code No. 740609.10)
 
 
产品详情请点击:CRISPR全基因组sgRNA文库系统
 

页面更新:2020-04-20 14:11:15

CRISPR/Cas9质粒系统酶试剂盒Takara


CRISPR/Cas9质粒系统
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Clontech 632601 Guide-it CRISPR/Cas9 System (Green) 1 System ¥4,534 CRISPR/Cas9质粒系统 CRISPR/Cas9质粒系统 CRISPR/Cas9质粒系统
Clontech 632602 Guide-it CRISPR/Cas9 System (Red) 1 System ¥4,534 CRISPR/Cas9质粒系统 CRISPR/Cas9质粒系统 CRISPR/Cas9质粒系统
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          CRISPR/Cas9质粒系统 CRISPR/Cas9质粒系统 CRISPR/Cas9质粒系统
CRISPR/Cas9质粒系统 CRISPR/Cas9质粒系统 CRISPR/Cas9质粒系统            
  基因敲入        
          CRISPR/Cas9质粒系统        
 
 
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CRISPR/Cas9质粒系统
对于使用CRISPR/Cas9 技术进行哺乳动物基因组编辑来说,Guide-it CRISPR/Cas9 系统是可以用于克隆和表达靶向单链向导RNA (single guide RNAs, sgRNAs)的试剂盒。该系统中的载体同时表达Cas9核酸酶、针对特定位点的sgRNA和明亮的荧光蛋白质。其中两种荧光蛋白质(ZsGreen1 和 tdTomato)可供选择,用于监测转染效率或在后期使用流式细胞仪富集/分选转染细胞时用到。使用该系统构建一个表达特异性序列的sgRNA的质粒非常简单;将用户提供的、与目标序列对应的两条核酸单链退火结合成为双链,再使用系统中包含的高效率连接混合液将双链插入到线性化的质粒中。这个试剂盒同样包括Stellar感受态细胞,确保高效率的转化。
 
产品特点:
· 单质粒载体:特异性靶向sgRNA的表达由人的U6启动子驱动,Cas9核酸酶及明亮的荧光标志(ZsGreen1 或 tdTomato)的表达由一个双向CMV启动子驱动。
· 荧光蛋白质tdTomato和ZsGreen1异常明亮:分别是EGFP亮度的6倍和2.5倍;这些标志物可以被用于监测转染效率、或使用流式细胞仪富集/分选转染细胞。
· 简便地构建质粒:针对您的靶序列设计的特异性寡核苷酸,然后使用试剂盒中提供的高效率混合液和高效的感受态细胞克隆到预先线性化的质粒中。
· 包含足够的试剂:足够用于构建表达10种不同的sgRNA的质粒。
 
产品应用:
使用CRISPR/Cas9技术对哺乳动物进行基因编辑时,靶向单链向导RNA(sgRNA)的克隆和表达。
 
产品组份:
Guide-it CRISPR/Cas9 System (Green) (Code No. 632601)
· pGuide-it-ZsGreen1 Vector (Linear)
· Guide-it Ligation Components
· Stellar Competent Cells

Guide-it CRISPR/Cas9 System (Red) (Code No. 632602)
· pGuide-it-tdTomato Vector (Linear)
· Guide-it Ligation Components
· Stellar Competent Cells

 
实验例:
CRISPR/Cas9质粒系统
分别接种1×105个HEK293、HeLa、U2OS、HT1080细胞至12孔板,培养16 h后,采用Xfect Transfection Reagent转染2.5 μg pGuide-it-ZsGreen1质粒至细胞。pGuide-it-ZsGreen1质粒包含分别以CCR5、C4BPB、EMX1为靶基因设计的sgRNA。
转染48 h后,通过荧光显微镜观察ZsGreen1荧光表达情况(A),通过FACS测定转染效率(B. Transfection%)。
采用Guide-it Mutation Detection Kit测定基因突变导入效率。以细胞为起始直接PCR扩增目的片段,扩增产物经过变性及退火后产生错配位点,之后Guide-it解离酶剪切错配位点。剪切产物经过凝胶电泳后,通过密度分析测定基因突变导入效率(B. Indel%)。
(数据来源于Takara Bio USA, Inc.)
 
 
 
产品详情请点击:CRISPR/Cas9质粒系统
 
 

页面更新:2020-03-05 10:52:36

CRISPR/Cas9慢病毒系统酶试剂盒Takara


CRISPR/Cas9慢病毒系统
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Clontech 632629 Lenti-X CRISPR/ Cas9 System 1 System ¥14,572 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统
Clontech 632630 pLVX-hyg-sgRNA1 Vector System 10 Rxns ¥4,610 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统
Clontech 632631 pLVX-puro-Cas9 Vector 20 μl ¥7,483 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统
Clontech 632633 Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System 1 System ¥22,832 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统
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          基因敲除    
          CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统
CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统 CRISPR/Cas9慢病毒系统            
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慢病毒介导的CRISPR/Cas9 系统
Lenti-X CRISPR/Cas9 System
Lenti-X CRISPR/Cas9 System是一个完整的由慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统。该系统包括Lenti-X Packaging Single Shots(用于产生高滴度的病毒)和两个不同的质粒载体(用于在靶细胞中表达Cas9 和客户自定义的sgRNA)。表达sgRNA的质粒系统pLVX-hyg-sgRNA1,易于插入客户自定义的sgRNA 序列,并且该系统提供足够的质粒供客户构建10种不同的sgRNA序列质粒。利用慢病毒导入sgRNA和Cas9基因,可以对难转染细胞系实现靶向基因编辑。
Lenti-X CRISPR/Cas9 System涉及到Cas9在靶细胞中的恒定表达,而Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System结合了Tet-On 3G 反式转录激活蛋白,这使得用户可以通过添加强力霉素(doxycycline)来诱导Cas9的表达。通过严格控制Cas9的表达,Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System可以使用户在细胞培养中,减少与Cas9稳定表达相关的毒性与脱靶效应。
 
■ 产品特点
· 利用病毒导入Cas9 基因和sgRNA ,使得一些难转染的哺乳动物细胞可以实现基因编辑,包括增殖细胞和非增殖细胞。
· Lenti-X Packaging Single Shots易于产生高滴度病毒。
· 由慢病毒介导客户自定义的sgRNA 和Cas9,用于哺乳动物使用CRISPR/Cas9 技术进行基因编辑。
· 通过严格控制Cas9的表达,Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System可以使用户在细胞培养中,减少与Cas9稳定表达相关的毒性与脱靶效应。
 
■ 产品应用
· 利用CRISPR/Cas9技术对哺乳动物基因组编辑时,以慢病毒为基础的、用户自定义sgRNA和 Cas9的导入系统。
 
■ 实验例
CRISPR/Cas9慢病毒系统
 
图1. 诱导敲除HEK293细胞中CD81基因
Tet-On 3G慢病毒转导靶细胞后采用G418筛选阳性单细胞克隆,选取24个单克隆分析荧光素酶报告基因的诱导表达倍数,选择荧光素酶报告基因背景量表达量最低的细胞克隆,然后以Cas9慢病毒(MOI=5)进行转导。转导后的靶细胞以1 μg/ml嘌呤霉素进行筛选,2周后,任意选择6个稳定细胞克隆分析Cas9的诱导表达倍数。将每个单克隆扩增培养的细胞分别接种至两个孔(12孔板)进行培养,其中一孔细胞添加0.5 μg/ml强力霉素诱导培养2天。采用抗Cas9的多克隆抗体(Code No. 632607)和ECL试剂通过Western blot分析Cas9诱导表达情况,抗体稀释比例为1:1,000。从中选取3个Tet-On 3G-Cas9-阳性细胞克隆(C-1, C-2和C-3)进行扩增培养并将其分别接种至2个孔(12孔板)中,CD81-sgRNA慢病毒(MOI=5)再次转导靶细胞,转导8小时后,添加0.5 μg/ml强力霉素至其中一孔进行诱导培养。6天后,收集细胞并采用FITC标记的抗人CD81抗体进行染色,通过FACS检测CD81表达情况。图A. Western blot检测结果显示了在添加0.5 μg/ml强力霉素(+)进行诱导或者不添加强力霉素(-)的情况下,6个分别独立的Tet-On 3G-Cas9-阳性细胞群Cas9蛋白质的表达情况。图B. FACS检测结果显示了CD81-sgRNA慢病毒转导的3个分别独立的Tet-On 3G-Cas9-阳性293T细胞群,在添加0.5 μg/ml强力霉素(+)进行诱导或者不添加强力霉素(-)的情况下,目的基因的敲除效率。在所检测的3个细胞群中,其中2个细胞群C-1和C-2在不添加强力霉素进行诱导的情况下基本不发生基因编辑现象,添加强力霉素进行诱导的情况下CD81基因的敲除效率分别为58.6%和30.7%。而另外一个细胞群C-3在不添加强力霉素进行诱导的情况下仍然会发生基因编辑现象,CD81基因的敲除效率为27.9%。
 
CRISPR/Cas9慢病毒系统
 
图2. 以可诱导的方式编辑HEK293细胞中AAVS1基因
通过qRT-PCR分析6个Tet-On 3G-Cas9-阳性HEK293稳定细胞系中Cas9的诱导表达情况。将HEK293细胞分别接种至2个孔(12孔板),以AAVS1-sgRNA慢病毒(MOI=5)进行转导。转导8小时后,添加0.5 μg/ml强力霉素至其中一孔诱导培养6天。6天后采用Guide-it Mutation Detection Kit (Code No. 631443)检测AAVS1基因编辑效率。图A.通过qRT-PCR方法检测每个细胞克隆分别在未经诱导(-Dox)和经过诱导(+Dox)的情况下Cas9蛋白质的表达情况。未经诱导和经过诱导的细胞的Ct值和ΔCt值标注在相对应一栏,计算出来的表达倍数差异标注在右侧一栏。多个细胞克隆的检测结果显示,在所检测的细胞克隆中1号克隆(绿色数字)具有最好的诱导性能,只有3号克隆(红色数字)在没有强力霉素诱导的情况下Cas9也会有所表达而且诱导性能较差。图B. Guide-it解离酶分析实验检测未经诱导(–)和经过诱导(+)的细胞克隆中AAVS1基因编辑效率。亲本细胞(未转导细胞)检测结果显示未经诱导和经过诱导的细胞所产生的片段大小是等同的。而经过诱导的稳转细胞系的检测结果显示产生了较小的基因片段,这说明在所检测的细胞克隆中都发生了AAVS1基因编辑现象。3号克隆在未经诱导的情况下也可以观察到剪切产物,这一点与qRT-PCR检测结果是相一致的。
 
CRISPR/Cas9慢病毒系统
 
图3. Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9系统载体组成
pLVX-EF1a-Tet3G载体编码表达Tet-On 3G转录激活蛋白质,由组成型启动子EF-1 alpha启动表达。与常用的CMV启动子相比,EF-1 alpha启动子在某些细胞类型(包括各种干细胞类型)中不易被沉默,所建立的诱导细胞系适用于长期使用。Tet-On 3G是由Tet-On Advanced转录激活蛋白质修饰而来,具有更高的强力霉素反应灵敏度。pLVX-TRE3G-Cas9-puro载体由诱导型启动子PTRE3GV启动表达经过优化的Cas9核酸酶。pLVX-TRE3G-Cas9-puro载体上的Cas9序列来源于杆菌属酿脓链球菌,进行了密码子优化以适用于哺乳动物细胞表达,另外在Cas9序列C端还引入了核定位信号(NLS)。pLVX-hyg-sgRNA1载体由组成型人U6启动子编码表达sgRNA(由用户设计并插入)。
 
CRISPR/Cas9慢病毒系统
 
图4.为可诱导型基因编辑选择优质的细胞克隆
通过分析Cas9表达情况或者分析未诱导的或者经过诱导的细胞群基因编辑情况来筛选优质的细胞克隆。虽然通过Western blot检测Cas9蛋白质表达情况有助于预筛选细胞克隆,但是CRISPR/Cas9介导的基因编辑是非常高效的,即使在通过Western blot检测不到Cas9蛋白质表达的情况下,在相应的细胞克隆中仍然有可能发生基因编辑现象。我们建议通过qRT-PCR方法来筛选Cas9背景表达量较低的细胞克隆,以避免在没有添加强力霉素的情况下发生基因编辑现象。图4上面一行显示的是优质细胞克隆(C-1)的检测数据,经过诱导的C-1细胞中Cas9蛋白质表达情况良好(Western blot,+),Cas9 mRNA背景表达水平非常低(qRT-PCR)。和未经诱导的细胞(-或者-Dox)相比,经过诱导的细胞(+或者+Dox)中Cas9的诱导表达使得基因编辑发生的频率更高,解离酶分析实验中小片段(蓝色箭头)的出现,FACS检测结果显示较大比例的细胞出现在“knockout”范围而未经诱导的细胞中基因编辑水平非常低都可以证实这一点。图4下面一行显示的是非优质细胞克隆(C-3)的检测数据,在未经诱导的细胞克隆(-)中即使通过Western blot没有检测到Cas9蛋白质的表达,但依然可以检测到Cas9 mRNA的表达(qRT-PCR)和基因编辑现象(解离酶,FACS)。
 
CRISPR/Cas9慢病毒系统
 
图5. LVX-hyg-CD81-sgRNA转导Jurkat或者HT1080细胞后采用潮霉素筛选稳定整合细胞系。之后采用LVX-puro-Cas9转导筛选获得的稳定细胞克隆,并采用嘌呤霉素再次进行筛选,通过FACS方法检测CD81敲除效率。以抗CD81抗体处理的未经Cas9转导的亲代细胞作为阳性对照,而未做抗体处理的亲代细胞作为阴性对照。
 
CRISPR/Cas9慢病毒系统
 
图6. 诱导敲除Jurkat细胞中CD81基因
按照实验手册操作流程建立Cas9背景表达较低的Tet-On 3G-Cas9-阳性Jurkat细胞,并以CD81-sgRNA慢病毒(MOI=5)连续转导两次。将成功转导的细胞接种至2个孔(12孔板)中并在其中一孔中添加0.5 μg/ml强力霉素(+Dox)诱导培养7天。采用FITC抗人CD81抗体进行检测并通过FACS进行分析,分析结果显示在未经强力霉素诱导的细胞(-Dox; top)中只有一小部分的细胞(0.4%)发生了基因编辑现象,而经过强力霉素诱导的细胞(+Dox; bottom)中发生CD81基因编辑的比例为32%。
 
■ 产品组份
Lenti-X CRISPR/Cas9 System (Code No.632629)
· pLVX-hyg-sgRNA1 Vector (Linear) (Code No. 632632,不单独销售)
· pLVX-puro-Cas9 Vector(Code No. 632631)
· Stellar Competent Cells(Code No. 636763)
· Guide-it Ligation Components v2 (Code No. 632615,不单独销售)
· Lenti-X Packaging Single Shots(Code No. 631275,不单独销售)

Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System (Code No. 632633)
· pLVX-hyg-sgRNA1 Vector (Linear)
· pLVX-TRE3G-Cas9-puro Vector Set
· pLVX-EF1a-Tet3G Vector
· Stellar Competent Cells
· Guide-it Ligation Components v2
· Lenti-X Packaging Single Shots

pLVX-hyg-sgRNA1 Vector System (Code No. 632630)
· pLVX-hyg-sgRNA1 Vector (Linear) (Code No. 632632,不单独销售)
· Guide-it Ligation Components v2 (Code No. 632615,不单独销售)
· Stellar Competent Cells(Code No. 636763)

 
 
产品详情请点击:CRISPR/Cas9慢病毒系统
 

页面更新:2020-03-05 10:58:09

CRISPR/Cas9腺相关病毒系统酶试剂盒Takara


CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Clontech 632608 AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2) 1 System ¥10,846 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
Clontech 632609 AAVpro CRISPR/Cas9 Vector System 1 System ¥6,766 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
Clontech 632618 AAVpro CRISPR/SaCas9 Vector System 1 System ¥5,931 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
Clontech 632619 AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2) 1 System ¥10,643 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
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          基因敲除    
          CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统 CRISPR/Cas9腺相关病毒系统            
  基因敲入        
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重组腺相关病毒基因编辑系统(AAV2)
AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2)
· 以病毒传递的方式导入Cas9基因和sgRNA,可以实现在难转染哺乳动物细胞中进行基因编辑,包括分裂细胞和非分裂细胞
· AAV病毒导入Cas9基因可以排除基因组整合和Cas9基因持续表达所带来的影响,降低脱靶效应
· 包装辅助质粒表达人microRNA miR-342有助于显著提高AAV病毒滴度
 
■ 产品说明:
我们可以提供两种CRISPR/Cas9 AAV2病毒粒子制备系统,无需辅助病毒,可采用Cas9进行基因编辑:AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System和AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free System。这两个试剂盒都可以用于将Cas9表达框和一个用户自定义的单向导RNA (sgRNA)导入至哺乳动物细胞中。Cas9基因序列来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)或者金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。AAV系统可用于广泛哺乳动物细胞类型,有效实现体外基因组修饰。CRISPR/Cas9系统采用两个AAV载体导入较大的S. pyogenes Cas9 (SpCas9),而由于SaCas9相对较小,CRISPR/SaCas9系统可以借助单个载体实现导入。sgRNAs可被直接一步克隆至预线性化的pAAV-Guide-it-Down或者pAAV-Guide-it-1质粒。无需辅助病毒,只需与试剂盒所包含的辅助质粒共转染HEK 293T细胞即可制备高滴度的AAV2病毒粒子。AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System (Code No. 632608) 和AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free System (Code No. 632619) 都是完整试剂盒,包含了sgRNAs克隆和AAV病毒粒子制备所需要的所有试剂。同样也包含了有效分离提取AAV2病毒粒子的AAV Extraction Solution。需要注意的是,SpCas9和SaCas9即使作用于基因组的同一区域,其靶向效率也是不同的–详细信息请见实验例。
 
AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free Systems (with S. pyogenes Cas9)
· SpCas9基因被分成两段分别承载在pAAV-Guide-it-Up和pAAV-Guide-it-Down两个质粒上,两段SpCas9基因之间有1.6-kb的区域是同源的,同源区域在靶细胞中通过同源重组形成全长SpCas9基因
· SpCas9使用的前间区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)序列为NGG,其中N代表任意碱基-详细信息请见AAVpro CRISPR/Cas9 Systems使用手册
· 所提供的pAAV-Guide-it-Down质粒是预线性化的,有利于一步克隆sgRNAs,降低由于质粒自连所产生的背景
 
AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free Systems (with S. aureus Cas9)
· SaCas9基因组装在单个质粒pAAV-Guide-it-1上,同时也包含了sgRNA表达框
· SaCas9 (来自于金黄色酿脓葡萄球菌)使用的前间区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM) 序列为NNGRR(T),其中N代表任意碱基,R代表A或者G碱基,(T)具有较强的偏好性-详细信息请见AAVpro CRISPR SaCas9 Systems使用手册
· 所提供的pAAV-Guide-it-1质粒是预线性化的,有利于一步克隆sgRNAs,降低由于质粒自连所产生的背景
 
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
图1. 全长Cas9和sgRNA产生。
 
pAAV-Guide-it-Up和pAAV-Guide-it-Down载体分别编码被删减的Cas9基因上游和下游部分,两者之间有1.6-kb同源重叠区域。将一个用户自定义的单向导RNA (sgRNA)克隆至pAAV-Guide-it-Down(见载体图谱)。pAAV-Guide-it-Up或者pAAV-Guide-it-Down与pRC2-mi342和pHelper载体共同转染HEK 293T细胞制备AAV2-Up或者AAV2-Down病毒。采用AAV Extraction Solution分离提取制备产生的病毒粒子。AAV2-Up和AAV2-Down病毒共转导靶细胞。AAV基因组处理过程中会在1.6-kb同源重叠区域发生同源重组,形成全长Cas9基因,转录并翻译成Cas9蛋白质。
 
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
图2. AAV载体重组产生全长Cas9和sgRNA。
 
Cas9基因较大导致不能将其包装至单个AAV病毒粒子中。pAAV-Guide-it-Up和pAAV-Guide-it-Down载体分别包含Cas9经过删减的上游和下游部分,这两部分之间具备1.6-kb同源重叠区域。采用两个质粒分别进行病毒包装制备病毒。制备完成的病毒共同转导靶细胞,通过同源重组形成全长Cas9基因(4.1 kb)。在靶细胞中表达的功能Cas9蛋白质由sgRNA导向至合适的基因型位点。
 
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
图3. pAAV-Guide-it-Up载体图谱。
 
这是pAAV-Guide-it-Up载体的结构。这个载体包含在AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System中,此系统用于制备AAV病毒粒子实现Cas9和sgRNA基因的细胞导入,这两者是进行CRISPR/Cas9基因编辑所必需的组分。由于Cas9基因较大,使得其不能包装在单个AAV病毒粒子中。为了可以实现AAV介导的Cas9基因的导入,此系统采用了两个单独的Cas9质粒。pAAV-Guide-it-Up载体包含一段被删减的Cas9基因上游部分(3,106 bp),由CMV启动子驱动编码Cas9 N端1,035个氨基酸。
 
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
图4. pAAV-Guide-it-Down载体图谱。
 
这是预线性化的pAAV-Guide-iT-Down载体的结构。这个载体包含在AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free system中,此系统用于制备AAV病毒粒子实现Cas9和sgRNA基因的细胞导入,这两者是进行CRISPR/Cas9基因编辑所必需的组分。由于Cas9基因较大,使得其不能包装在单个AAV病毒粒子中。为了可以实现AAV介导的Cas9基因的导入,此系统采用了两个单独的Cas9质粒。pAAV-Guide-it-Down载体包含了一段被删减的Cas9基因下游部分(2,616 bp),编码Cas9 C端872个氨基酸。一个用户自定义的单向导RNA (sgRNA)可被克隆至pAAV-Guide-it-Down载体中,位于人U6启动子的下游。要构建这个载体,需要先将作用于基因组靶位点的一对寡核苷酸链(向导序列)退火形成双链,然后将形成的双链DNA克隆至预线性化的载体中。
 
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
图5. HEK 293T细胞制备的AAV2-Up和AAV2-Down 病毒粒子的基因组滴度相同。
 
采用AAVpro Extraction Solution从HEK 293T细胞中分离提取AAV2-Up和AAV2-Down病毒粒子(参考protocol overview)。采用AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR)检测基因组滴度。3次平行实验的结果表明所获得的AAV2-Up和AAV2-Down基因组滴度相近。
 
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
图6. 与质粒转染相比,尤其针对难转染的细胞系,AAVpro CRISPR/Cas9系统会产生更多的基因突变。
 
转导前1天将所标注的细胞类型(1.0 x 105 cells)接种至12孔板中。作用于CCR5 基因的AAV2-Up和AAV2-Down病毒粒子以1.0 x 105 MOI(基因组滴度)转导靶细胞。72小时后,收集细胞并采用Guide-it Mutation Detection Kit进行分析。作为对照,采用Xfect Transfection Reagent转染编码Cas9和靶向CCR5基因的向导序列的质粒(P: 2.5 μg)至靶细胞。
 
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
图7. AAVpro CRISPR/SaCas9系统通过单个载体表达SaCas9和sgRNA。
 
pAAV-Guide-it-1以预线性化形式提供,用于插入sgRNA靶序列(橘色标注部分为sgRNA)。采用此载体包装获得的病毒转导靶细胞时,靶细胞会同时表达进行基因编辑的SaCas9和sgRNA。
 
CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
图8. Guide-it Mutation Detection Kit平行比较采用AAVpro CRISPR/Cas9 System (SpCas9)和AAVpro CRISPR/SaCas9 System产生的基因组修饰
 
CYP2外显子1两个不同的基因组区域为靶位点,孔1和2显示每个酶的检测结果,凝胶图下面的图显示靶区域。每个细胞类型的突变百分比标注在每个孔下面。转导前1天将3种不同细胞系分别接种1 x 105个细胞至12孔板。采用两载体系统AAVpro CRISPR/Cas9 System (SpCas9)或者单载体系统AAVpro CRISPR/SaCas9 System制备的病毒粒子以1.0 x 105 MOI(基因组滴度)转导靶细胞。72小时后,收集细胞并采用Guide-it Mutation Detection Kit进行分析 。
 
■ 产品组份
AAVpro CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2)(Code No. 632608)
1. AAVpro CRISPR/Cas9 Vector Set
pAAV-Guide-it-Up Vector 500 ng/μl
pAAV-Guide-it-Down Vector(Linear) 7.5 ng/μl
2. Guide-it Ligation Components
DNA Ligation Mighty Mix  
Guide-it Oligo Annealing Buffer  
Guide-it Control Annealed Oligos 100 fmol/μl
Guide-it Sequencing Primer 1 100 pmol/μl
PCR-Grade Water  
3. Stellar Competent Cells(Code No. 636763)
4. pRC2-mi342 Vector(1 μg/μl)
5. pHelper Vector(1 μg/μl)
6. AAVpro Extraction Solution
    AAV Extraction Solution A 1.5 ml×3
    AAV Extraction Solution B 150 μl×3
 
AAVpro CRISPR/Cas9 Vector System(Code No. 632609)
1. AAVpro CRISPR/Cas9 Vector Set
20 μl pAAV-Guide-it-Up Vector 500 ng/μl
20 μl pAAV-Guide-it-Down Vector(Linear) 7.5 ng/μl
2. Guide-it Ligation Components
DNA Ligation Mighty Mix  
Guide-it Oligo Annealing Buffer  
Guide-it Control Annealed Oligos 100 fmol/μl
Guide-it Sequencing Primer 1 100 pmol/μl
PCR-Grade Water  
3. Stellar Competent Cells(Code No. 636763)
 
AAVpro CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)(Code No. 632619)
1. pAAV-Guide-it-1 Vector (Linear) (7.5 ng/μl) 20 μl
2. Guide-it Ligation Components v3
 
DNA Ligation Mighty Mix 50 μl
Guide-it Oligo Annealing Buffer 1.5 ml
Guide-it Control Annealed Oligos v3 (100 fmol/μl) 10 μl
Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl) 10 μl
PCR Grade Water 1 ml
3. Stellar Competent Cells(Code No. 636763)
4. pRC2-mi342 Vector(1 μg/μl) 20 μl
5. pHelper Vector(1 μg/μl) 20 μl
6. AAVpro Extraction Solution
 
AAV Extraction Solution A 1.5 ml×3
AAV Extraction Solution B 150 μl×3
 
AAVpro CRISPR/SaCas9 Vector System(Code No. 632618)
1. pAAV-Guide-it-1 Vector (Linear) (7.5 ng/μl) 20 μl
2. Guide-it Ligation Components v3
 
DNA Ligation Mighty Mix 50 μl
Guide-it Oligo Annealing Buffer 1.5 ml
Guide-it Control Annealed Oligos v3 (100 fmol/μl) 10 μl
Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl) 10 μl
PCR Grade Water 1 ml
3. Stellar Competent Cells(Code No. 636763)
 
■ 保存
Stellar Competent Cells:-80℃
其它:-20℃
(AAVpro Extraction Solution溶解后置于室温保存)
 
 
 
产品详情请点击:CRISPR/Cas9腺相关病毒系统
 
 

页面更新:2020-03-05 10:39:22