Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 可精准检测目标 RNA，多重扩增检测性能优异，一次可检测多达 5 个靶标。
• 单管预混液剂型使反应体系的建立更便捷
• 4X 浓度的预混液可增加样品加入量，提高 RT-qPCR 灵敏度
• 一次可检测多达 5 个靶标，增加检测通量
• Luna 温启动反转录酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶联合使用，提高反应特异性及稳定性并可室温建立体系
• 预混液中包含 UDG 和 dUTP，防止模板残留污染
• 无干扰的可见示踪染料避免加样错误
• 点击 COVID-19 research 了解 NEB 如何将多种 RT-qPCR 病毒检测方法用于新冠研究
Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 用于探针法实时荧光定量检测靶标 RNA。首先反转录酶将 RNA 转化为 cDNA，然后 DNA 聚合酶对 cDNA 进行扩增，完成靶标的实时荧光定量 PCR（qPCR），整个过程在单管内一次性完成。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。
该预混液基于探针法化学原理，采用一步法 RT-qPCR 流程，因此可与 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒(NEB #E3006)进行对比
图 1：用于一步法 RT-qPCR 实验的新产品
Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 预混液，含 UDG 为 4X 浓度，因此在靶标 RNA 量极低的应用中（例如：病原体检测），可提高样品加入量。通过对 5 个靶标进行不同浓度的线性、灵敏度检测，显示该产品在多重检测中性能更优。该预混液将一步法 RT-qPCR 所需组分整合到单个试管中，包括：Luna 温启动反转录酶、Taq 热启动 DNA 聚合酶、dNTP 和小鼠 RNase 抑制剂。Taq 热启动 DNA聚合酶与新型温启动反转录酶联合使用，可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增，从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性，最佳反应温度为 55°C。此外，预混液还添加了独特矫对染料，可与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。
图 2：使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对不同 RNA 病毒进行检测显示性能卓越
使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对 SARS-CoV-2（N1）和流感病毒 H1N1（HA）进行 RT-qPCR。反应体系为 20 ul，对 5-log 浓度梯度样品进行扩增性能评估，使用两台荧光定量仪器进行平行测试。（A）10–100,000 拷贝合成 SARS-CoV-2 RNA 对照 2（Twist Biosciences，SKU：102024）溶于 10 ng Jurkat 总 RNA 中（BioChain，＃R1255815-50）。（B）12.4–124,000 拷贝甲型流感病毒（H1N1）RNA（ATCC®VR-95DQ™）溶于 10 ng Jurkat 总 RNA 中。结果显示两个病毒靶标扩增的灵敏度和线性度都很理想。
图 3：使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 进行多重检测（5 个靶标）
使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对 5-log 浓度梯度的 Jurkat 总 RNA（100 ng-10 pg）进行多重 RT-qPCR，实验仪器为 Bio-Rad CFX96 荧光定量仪。结果显示了 5 个人源靶基因的扩增标准曲线和扩增效率。反应体系（20 μl）中引物和探针浓度均为 200 nM，反应设置为产品推荐的循环条件。在该多重反应中，5 个靶标均检测到良好的线性度、扩增效率和 R2 值。
图 4：Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 性能优于其它品牌
两位实验人员按照操作说明书，在几天的时间内，使用 Applied Biosystems™ QuantStudio™ 6 实时 PCR 系统，用两种荧光定量试剂盒分别对 8 个不同丰度、长度和 GC 含量的靶标（通过不同颜色显示）进行一步法 RT-qPCR 测试。反应结果就以下方面进行评估：扩增效率、低样品量检测能力及无模板扩增值（ΔCq=无模板对照的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq）。此外，基于前面的度量值（质量得分）还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量。结果显示：参与测试的两种试剂均表现不错，但 NEB 测试结果落在绿框里的数量更多，因此 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 性能优于 TaqPath 1-Step RT-qPCR预混液。
RT-qPCR 的高灵敏度使得避免 DNA 污染尤为重要。由于先前扩增产物可作为后续反应的底物，因此反应体系加入 dUTP 和热敏 UDG 可防止模板残留污染。热敏 UDG 超过50°C时会完全失活，因此对 qPCR 性能没有影响。
图 5：RT-qPCR 避免模板残留污染的评估
为了评估不同试剂盒对去除模板残留物的能力，首先使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒制备含 U 的 RT-qPCR 产物。然后使用三种不同的 RT-qPCR 预混液（均包含 UDG），将~105 拷贝的含 U 产物作为模板进行 qPCR。按照各品牌的操作说明，在第二个反应开始时进行 25°C 孵育使 UDG 降解含 dU 样品，以降低其产生（假）阳性信号的能力。ΔCq 是进行残留处理及未处理的循环数的差值。ΔCq 值越大说明去除残留产物的效率越高。使用 Luna 预混液去除污染后，一个样品中含 U 产物完全消化，另一个样品 ΔCq 较大。注意：在真实污染案例中，污染的 DNA 量很难评估/预测。
该预混液包含无荧光的可见蓝色示踪染料，有助于透明管加样。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠，也不会干扰实时检测。
Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 包含无干扰的可见蓝色示踪染料可避免加样错误
