Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX) 货 号 #M3029ENEB酶试剂 New England Biolabs

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产品资料 – DNA聚合酶与扩增技术 – qPCR & RT-qPCR

Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)                              收藏

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#M3029E
2000 rxns
26,279.00

#M3029L
500 rxns
8,379.00

#M3029S
200 rxns
3,719.00

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特性

 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)可精准检测目标 RNA,多重扩增检测性能优异,一次可检测多达 5 个靶标。

        特性
适用于不需要 ROX 参比染料的仪器
4X 浓度的预混液可增加样品加入量,提高 RT-qPCR 灵敏度
一次可检测多达 5 个靶标,增加检测通量
Luna 温启动反转录酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶联合使用,提高反应特异性及稳定性,并可室温建立体系
预混液中包含热敏 UDG 和 dUTP,防止模板残留污染
无干扰的可见示踪染料避免加样错误
点击 COVID-19 research 了解 NEB 如何将多种 RT-qPCR 病毒检测方法用于新冠研究
 

概述

 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)用于探针法实时荧光定量检测靶标 RNA。首先反转录酶将 RNA 转化为 cDNA,然后 DNA 聚合酶对 cDNA 进行扩增,完成靶标的实时荧光定量 PCR(qPCR),整个过程在单管内一次性完成。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性,将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光,并实时监测荧光值的增加,以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置,可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。

 
Luna 探针一步法 RT-qPCR 预混液,含 UDG(无 ROX)为 4X 浓度,因此在靶标 RNA 量极低的应用中(例如:病原体检测),可提高样品加入量。通过对 5 个靶标进行不同浓度的线性、灵敏度检测,显示该产品在多重检测中性能更优。该预混液将一步法 RT-qPCR 所需组分整合到单个试管中,包括:Luna 温启动反转录酶、Taq 热启动 DNA 聚合酶、dNTP 和小鼠 RNase 抑制剂。Taq 热启动 DNA 聚合酶与新型温启动反转录酶联合使用,可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增,从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性,最佳反应温度为 55°C。该剂型不含参比染料,适用于不需要 ROX 参比染料的仪器(如需 ROX 矫正,可添加 ROX)。
 
RT-qPCR 的高灵敏度使得避免 DNA 污染尤为重要。由于先前扩增产物可作为后续反应的底物,因此反应体系加入 dUTP 和热敏 UDG 可防止模板残留污染。热敏 UDG 超过 50°C时会完全失活,因此对 qPCR 性能没有影响。
 
图 1:使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)检测病毒 RNA
 
Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)            货   号                  #M3029E
使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)对 SARS-CoV-2(N1 基因)、Zika(POLY 基因)、Dengue(E 基因)、Chikungunya(E2 糖蛋白基因)进行 RT-qPCR 检测。配制 20 ul 反应体系,对 5-log 浓度梯度样品(100,000–10 拷贝/反应)进行扩增性能评估,实验仪器为 Bio-Rad® CFX96 实时荧光定量仪。扩增模板为:新冠状病毒(SARS-CoV-2)合成 RNA Control 2(Twist Biosciences,SKU:102024)、寨卡病毒(ZIKV)合成 RNA(ATCC® VR-3252SD™)、2 型登革热病毒(Dengue)合成 RNA(ATCC VR-3229SD™),基孔肯雅病毒(Chikungunya)合成 RNA(ATCC VR-3246SD™),上述模板分别稀释于 10 ng Jurkat 总 RNA(BioChain,#R1255815-50)中。结果显示:所有病毒靶基因扩增的灵敏度和线性度都非常理想。
 
图 2:Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG,含或不含 ROX 剂型多重扩增性能一致
 
Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)            货   号                  #M3029E
 
使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG,含或不含 ROX 剂型(NEB# M3019 和 NEB # M3029)对 5 log 浓度范围(100 ng至10 pg)的 Jurkat 总 RNA 进行多重 RT-qPCR,实验仪器为 Bio-Rad® CFX96 实时荧光定量仪。分别使用两种 Luna 试剂对 5 个人源靶基因制作扩增标准曲线。配制 20 μl 反应体系,其中引物和探针浓度均为 200 nM,使用产品推荐的循环条件。如 B 图所示,两种 Luna 试剂的 ACTIN(使用 Texas Red 标记探针)标准曲线重叠,这说明在没有 ROX 参比染料的情况下,扩增性能良好。如 C 图所示:针对 5 个靶基因的多重线性检测,均展现出良好的扩增效率和 R2 值。
 
图 3:探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG,含或不含 ROX 剂型均可得到高质量结果
 
 Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)            货   号                  #M3029E
两位实验人员分别按照操作说明书,使用 Bio-Rad CFX96 实时荧光定量仪器,用两种荧光定量试剂盒分别对 8 个不同丰度、长度和 GC 含量的靶标(通过不同颜色显示)进行一步法 RT-qPCR 测试。反应结果就以下方面进行评估:扩增效率、低样品量检测能力及无模板扩增值(ΔCq=无模板对照的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq)。此外,基于前面的度量值(质量得分)还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量。结果显示:Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)(NEB #M3029)和 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(NEB #M3019)落在绿框里的结果数量相同,即两者检测性能一致。
 
该预混液包含无荧光的可见蓝色可见示踪染料,有助于透明管加样。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠,也不会干扰实时检测。
 
图 4:Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)包含无干扰的可见蓝色示踪染料可避免加样错误

 
Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)            货   号                  #M3029E