日本同仁化学Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒- DOJINDO

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Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256
乳酸检测试剂盒
Lactate Assay Kit-WST
商品信息
储存条件:0-5度保存,避光
运输条件:室温

特点:

 

● 细胞上清液和细胞样品均适用

● 操作简便

● 灵敏度高最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸

● 试剂稳定性高

● 享有显色底物WST专利

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葡萄糖乳酸检测

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代谢检测方案

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

产品解说
活动进行中
试剂盒内含
概述
原理
特点
乳酸标准曲线
实验例
常见问题Q&A
参考文献

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试剂盒内含

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

概述

乳酸是细胞的一种主要代谢途径-糖酵解的代谢产物,也是肌肉疲劳和高乳酸血症的重要生物标志物。它还可以作为监测细胞内代谢途径变化的标志物。此外最近的代谢研究表明,乳酸是组织和癌细胞的三羧酸循环中碳的主要来源。

Lactate Assay Kit-WST®可用于定量检测糖酵解代谢产生的乳酸,并优化了定量过程。本试剂盒通过测定WST®的显色反应来定量细胞上清液中的乳酸含量,可用96孔板检测,灵敏度高,最低可检测到0.02 mmol/l的乳酸。

WST®:WST是日本同仁化学研究所的注册商标

原理

本试剂盒通过测定WST的显色反应来定量细胞上清或细胞内的乳酸含量。

另外,试剂盒中含有乳酸标准液,可以通过制备标准曲线来定量样品中的乳酸浓度。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

特点

特点1:操作简单,只需要加入试剂

只需在加入细胞裂解液的细胞上清液中加入试剂,培养即可。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

特点2:试剂稳定性高

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

乳酸标准曲线

可以从使用试剂盒中的乳酸标准液制作出乳酸标准曲线,然后通过标准曲线求出样品中的乳酸浓度。

当乳酸浓度在1 mmol/l以上时,可以通过稀释样品进行检测。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

实验例

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用 

1、在96孔板中接种1×104个/孔的HeLa细胞(MEM培养基中含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素),在37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

2、去除上清液后,在培养基中加入100 µl配制好的系列浓度的2-脱氧-D-葡萄糖溶液。

3、在37℃,5% CO2培养箱中过夜培养。

4、培养后,吸取20 µl细胞上清液至1.5 ml微量管中,并用超纯水稀释8倍制备样品溶液,然后按照说明书的图3在每孔中加入20 µl样品溶液。

5、按照“配制乳酸标准液”的方法配制乳酸标准液。

6、在96孔板中按照说明书的图3在每孔中加入20 µl各种浓度的乳酸标准液。

7、在每孔中加入80 µl工作液。

8、在37℃培养箱中培养30 min。

9、用酶标仪测定450 nm的吸光度,并用标准曲线计算样品的乳酸浓度。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

2-脱氧-D-葡萄糖对糖酵解的抑制作用,随着2-脱氧-D-葡萄糖 (一种糖酵解抑制剂)浓度的增加,乳酸浓度逐渐减少

葡萄糖和乳酸的测定例

用葡萄糖测定试剂盒(货号:G264)和乳酸测定试剂盒检测(货号:L256):检测将葡萄糖转运蛋白抑制剂Phloretin添加到Jurkat细胞时的代谢活性变化。

 

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

■实验条件

细胞:Jurkat细胞(5×105细胞)

药物:Phloretin(终浓度:100 µmol/l)

培养时间:过夜培养

■结果

Phloretin的添加抑制了葡萄糖的摄取,减少了葡萄糖的消耗,增加了培养基中葡萄糖的量,并减少了乳酸的量。

常见问题Q&A

Q:使用含有血清的培养基,可以测定培养上清液中的乳酸吗?
A:使用含有血清的培养基,可以测定培养上清液中的乳酸。
但是在含有血清的情况下,由于背景上升,需要测定培养基OD值并将其作为背景对照减去。
【参考数据】
含和不含10%FBS的吸光度比较

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

<结果>
在培养基中加入10%FBS的组吸光度大大升高,因此需要测定培养基作为背景对照。

Q:如何检测细胞内乳酸含量?
(1)用微量管收集1×105的细胞*1

(2)以300×g离心2 min后去除上清液。

(3)加入300 μl的PBS,用移液器吹打使其重悬,再以300×g离心2 min后去除上清液。
(4)加入300 μl细胞裂解液*2(0.1%Triton-X)并涡旋1 min,制成细胞裂解液。

(5)以8000×g离心5 min,收集上清液。
(6)将步骤(5)所得溶液用超滤离心管(PALL,No.OD010C3,滤膜分子量:10K)以12,000×g 离心10 min*3去除蛋白质,得到待测样品。

*1、样品为HeLa细胞时,为了检测出0.02 mmol/l以上的乳酸含量,需要1×105的细胞甚至更多。
*2、如果细胞裂解液中含有SDS会抑制显色,因此不要使用含有SDS的缓冲液。

*3、内源性乳酸脱氢酶(LDH)会导致背景增高,因此通过脱蛋白处理去除内源性乳酸脱氢酶

(LDH)。
※测定样品设定为3个复孔时(n=3),合计至少需要60 μl以上(每孔20 μl×3)。
※如果过滤后滤液不足60 μl,可适当延长过滤时间。
※稀释细胞裂解液至合适的浓度,使结果在标准曲线范围内(0-1 mmol/l)。

Q:配制后的Working   Solution稳定性如何,可以保存多久?
A:Working Solution需要现配现用。
光会影响Working Solution的稳定性,所以配制后请用铝箔纸包裹。
配制后的Working Solution在室温避光条件下可以保存4 h。
(Working Solution遇到光,溶液的颜色会由红色变为橙色,背景会升高。)
Q:为什么我的样品孔没有显色?
A:样品中的乳酸浓度可能低于检测限(0.02 mmol/l)。
乳酸浓度低于0.02 mmol/l的样品无法用该试剂盒检测,因此请考虑其他方法,如LC-MS。
如果待测样品被稀释,则稀释样品中含有的乳酸浓度可能低于0.02 mmol/l。
请降低稀释比例,从而将检测样品的乳酸浓度调整到最低检测限以上。
Q:是否可以检测含有还原性物质的样品?
A:如果样品中含有还原性的物质,则WST染料也会发生显色,此时无法准确定量乳酸浓度。
实验中如遇到以上情况,可以设定药物对照(不含细胞含药物的培养基+试剂),
并将标准品孔和样品孔的吸光度分别减去药物对照的吸光度。
Q:该试剂盒可以定量D-Lactate吗?
A:该试剂盒是用于L-Lactate的定量,不能定量D-Lactate。
Q:是否可以使用450 nm以外波长的滤光片进行检测?
A:也可以使用490 nm的滤光片, 但是吸光度会低于在450 nm处的吸光度。
Q:一个试剂盒可以检测样品的数量。
A:制备标准曲线和样品(n=3)时,可以检测的样品数量如下所示。

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

标准曲线:8个点(0, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mmol/l)(n=3)

Lactate Assay Kit-WST试剂盒货号:L256 乳酸检测试剂盒

96孔板排列示意图(n=3)

参考文献

编号 文献名 年分 IF
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2 Serine   racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from   serine 2020 19.9
3 YAP   mediates compensatory cardiac hypertrophy through
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2022 19.5
4 Serine   racemase enhances growth of colorectal cancer by producing pyruvate from   serine,
Nature Metabolism,2020, 2,81–96
2020 13.5
5 Polymer-conjugated   glucosamine complexed with boric acid shows tumor-selective accumulation and   simultaneous inhibition of glycolysis, Biomaterials,2021, 269:120631 2020 12.8
6 Metabolome   Analysis Reveals Excessive Glycolysis via PI3K/AKT/mTOR and RAS/MAPK   Signaling in Methotrexate-Resistant Primary CNS Lymphoma-Derived Cells,   Clinical Cancer Research,2020, 26(11):2754-2766 2020 11.2
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8 Epigenetic silencing   of LncRNA LINC00261 promotes c-myc-mediated aerobic glycolysis by regulating   miR-222-3p/HIPK2/ERK axis and sequestering IGF2BP1 2021 8.8
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12 Tumor cell-derived   angiopoietin-like protein 2 establishes a preference for glycolytic   metabolism in lung cancer cells 2020 6.5
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22 Novel   pharmacological effects of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib   on the lactate dehydrogenase pathway, Biochemical and Biophysical Research   Communications,2019, 510(4):501-507 2019 3.6
23 Neopetrosidines   A–D, pyridine alkaloids isolated from the marine sponge
Neopetrosia chaliniformis and their cell cycle elongation activity
2021 3.5
24 Novel pharmacological   effects of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib on the lactate   dehydrogenase pathway 2019 3.3
25 Circ_0000442   functions as a tumor repressor in breast cancer by impacting miR-1229-3p and   upregulating ZBTB1 2020 2.5
26 Suppressive Effects   of Anisomycin on the Proliferation of B16 Mouse Melanoma Cells In Vitro 2021 2.1
27 Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration 2023 15.1
28 Arresting calcium-regulated sperm metabolic dynamics enables prolonged fertility in poultry liquid semen storage 2023 4.6
29 Exosomes secreted by ST3GAL5high cancer cells promote peritoneal dissemination by establishing a premetastatic microenvironment 2023 6.6